BADANIA PRZESIEWOWE TECHNIKĄ MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) U DZIECI Z ZABURZENIEM ROZWOJU I NIEPEŁNOSPRAWNOŚCIĄ INTELEKTUALNĄ O NIEOKREŚLONEJ ETIOLOGII

MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) AS A SCREENING TEST IN CHILDREN WITH DEVELOPMENTAL DEFECTS AND INTELLECTUAL DISABILITY OF UNKNOWN ETIOLOGY

Izabela Łaczmańska1, Aleksandra Jakubiak1, Ryszard Ślęzak1, Karolina Pesz1, Agnieszka Stembalska1, Łukasz Łaczmański2, Maria M. Sąsiadek1, Robert Śmigiel1,
1Katedra i Zakład Genetyki, Akademia Medyczna we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab. M.M. Sąsiadek
2Katedra i Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Leczenia Izotopami,
Akademia Medyczna we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab. A. Milewicz
Streszczenie
Zaburzenia rozwoju i niepełnosprawność intelektualna stanowią ważny problem medyczny i społeczny, który dotyczy 1-3% populacji. W ponad połowie przypadków ich przyczyny pozostają nieokreślone.
Cel: Celem pracy jest ocena skuteczności badania MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification) jako metody przesiewowej w diagnostyce pacjentów z zaburzeniami rozwoju i niepełnosprawnością intelektualną.
Materiał i metody: Badanie MLPA wykonano u 256 pacjentów Poradni Genetycznej skierowanych z powodu zaburzeń rozwoju i/lub niepełnosprawności intelektualnej o nieznanej etiologii. Z badań wykluczono pacjentów, u których postawiono rozpoznanie konkretnych zespołów genetycznych. Pozytywne wyniki MLPA potwierdzono badaniem FISH z zastosowaniem odpowiednich sond.
Wyniki: U 256 pacjentów wykonano 313 badań MLPA. Mikroaberracje chromosomowe zidentyfikowano u 15 pacjentów (4,8%): delecję 1p36 w 4 przypadkach, po jednym przypadku: delecję 22q11.21, 22q13.33, SNRPN1, 4ptel, 6qtel, 7q11.23, 16ptel, 18qtel, a także delecję 3ptel/duplikację 15qtel; delecję 18qtel/duplikację Xqtel oraz duplikację 7q11.23. Pacjentów ze stwierdzoną mikroaberracją chromosomową poddano szczegółowej analizie klinicznej.
Wnioski: U każdego dziecka z zaburzeniem rozwoju i/lub z niepełnosprawnością intelektualną o nieznanym pochodzeniu oraz z prawidłowym wynikiem badania cytogenetycznego, powinno być wykonywane przesiewowe badanie molekularne MLPA w kierunku zespołów mikroaberracji chromosomowych, nawet, jeżeli brak jest dodatkowych wad rozwojowych oraz obciążonego wywiadu rodzinnego.

Słowa kluczowe: zaburzenia rozwoju, niepełnosprawność intelektualna, MLPA, mikroaberracje subtelomerowe

Abstract
Developmental delay and intellectual disability are significant medical and social problems which concern 1-3% of population. The etiology remains unknown in over half of the cases.
Aim: : To evaluate the efficiency of MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) as a screening test in diagnosis of patients with developmental delay and/or intellectual disability.
Material and methods: 313 MLPA tests were performed in 256 patients with developmental delay and/ or intellectual disability with unknown etiology. MLPA test was made after exclusion of genetic disorders possible to diagnose by dysmorphological examination or using specific genetic tests. Positive results were confirmed by FISH analysis with appropriate probes.
Results: Chromosomal microaberrations were identified in 15 patients (4,8%): deletions of 1p36 in 4 cases, in one case deletion of 22q11.21, 22q13.33, SNRPN1, 4ptel, 6qtel, 7q11.23, 16ptel, 18qtel as well as one ca se of deletion 3ptel/duplication 15qtel; deletion 18qtel/duplication Xqtel, and also duplication 7q11.23. Detail clinical analysis was performed in patients with diagnosed microaberrations in MLPA test.
Conclusions: The molecular MLPA test, screening for chromosomal microaberration syndromes, should be performed in each patient with developmental delay and/or intellectual disability of unknown etiology and normal cytogenetic analysis, even if congenital defects and positive familial history do not exist.

Key words: developmental defects, mental retardation, MLPA, subtelomeric microaberrations

WSTĘP
Zaburzenie rozwoju i niepełnosprawność intelektualna (NI), dotyczące 1-3% populacji ogólnej, stanowią ważny problem medyczny i diagnostyczny, ale także społeczny i ekonomiczny. Zaburzenia te dotyczą zarówno pacjentów ambulatoryjnych jak i szpitalnych, niejednokrotnie ze złożoną i skomplikowaną historią choroby oraz brakiem medycznych i społecznych efektów leczenia (1, 2, 3).
W ponad połowie przypadków przyczyny zaburzeń rozwojowych, jak i niepełnosprawności intelektualnej pozostają nieokreślone. Czynniki genetyczne (chromosomowe, monogenowe, poligenowe oraz wieloczynnikowość) mają coraz większe znaczenie w etiopatogenezie zaburzeń rozwoju w wyniku poprawy opieki prenatalnej i okołoporodowej a także eliminacji wielu czynników infekcyjnych i szkodliwych czynników środowiskowych (4). Obecnie w katalogu internetowym OMIM (Online Mendeltelian Inheritance in Man) opisanych jest kilka tysięcy chorób genetycznych, w których obrazie klinicznym występuje niepełnosprawność intelektualna (5). Właściwe rozpoznanie przyczyny zaburzeń rozwoju ma istotne znaczenie dla ustalenia odpowiedniego schematu postępowania rehabilitacyjnego, jak również dla poradnictwa genetycznego, w tym prekoncepcyjnego i prenatalnego, obejmującego zarówno pacjenta jak i jego rodzinę. Znajomość przyczyny zaburzenia pozwala także podwyższyć standard opieki nad pacjentami z niepełnosprawnością intelektualną (3, 6, 7). Obowiązujący obecnie algorytm w diagnostyce genetycznej zaburzeń rozwojowych i niepełnosprawności intelektualnej polega na wykluczeniu w pierwszej kolejności niezrównoważonych aberracji chromosomowych przy zastosowaniu technik cytogenetyki klasycznej. Jednak rozdzielczość tej metody jest niewystarczająca w celu diagnostyki mikroaberracji. Najmniejsza zmiana, która jest możliwa do wykrycia przy użyciu klasycznych technik analizy chromosomów wynosi, w zależności od rozdzielczości prążkowej, około 2-7x106 par zasad (pz) (8). Techniką pozwalającą na detekcję mikroaberracji strukturalnych chromosomów jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH – Fluorescent in situ Hybridization) z zastosowaniem sond specyficznych. Technika ta wymaga jednak postawienia konkretnego rozpoznania klinicznego, co umożliwia dokonanie prawidłowego wyboru sondy fluorescencyjnej do badania. W przypadku podejrzenia mikroaberracji subtelomerowych, niezbędne jest zastosowanie całego panelu sond subtelomerowych (dla wszystkich chromosomów), co oznacza konieczność przeprowadzenia hybrydyzacji, a następnie analizy, co najmniej kilkunastu obszarów hybrydyzacyjnych i wiąże się z dużymi kosztami (9, 10, 11).
Metodą cytogenetyki molekularnej pozwalającą na detekcję zmian rzędu 3Mpz jest porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH – Comparative Genomic Hybridization). Znaczne zwiększenie jej rozdzielczości zapewnia zastosowanie mikromacierzy (CGH do mikromacierzy, array -CGH). Technika ta umożliwia detekcję mikroaberracji wielkości rzędu od 1 Mpz do 15 kpz. Jednakże używanie tej metody do diagnostyki NI jest wciąż ograniczone ze względu na wysoki koszt pojedynczego oznaczenia oraz wysokie wymagania sprzętowe (3, 12). Techniką molekularną służącą między innymi do badania mikroaberracji jest MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) pozwalająca na względną ilościową ocenę do czterdziestu różnych sekwencji nukleotydowych podczas jednej reakcji. Wpływa to na jej stosunkowo niskie koszty odczynnikowe. W pojedynczej reakcji MLPA wymagającej od 20 do 100 ng DNA pacjenta, można zbadać od 40 do 45 różnych sekwencji w krytycznych obszarach, np. na chromosomie X lub wszystkich sekwencji subtelomerowych. MLPA znajduje zastosowanie w diagnostyce zespołów mikrodelecyjnych, w tym subtelomerowych, w aneuploidii nowotworów, a także wielu chorób warunkowanych delecjami lub amplifikacjami fragmentów genomu. Podczas badania używa się specyficznych sond połówkowych (half-probes) hybrydyzujących do komplementarnych odcinków DNA pacjenta, które w przypadku dokładnej hybrydyzacji, niezaburzonej istniejącymi u pacjenta mutacjami, ulegają następnie ligacji i służą jako matryca dla polimerazy DNA. Użycie do reakcji PCR znakowanych starterów umożliwia, podczas elektroforezy kapilarnej, ilościową ocenę produktów PCR dla poszczególnych badanych sekwencji. Wysokość pików uzyskanych podczas elektroforezy kapilarnej odpowiada ilości produktu PCR, czyli liczby sond, które uległy ligacji, a co za tym idzie – pośrednio liczby kopii fragmentów DNA użytego do badania. Taka ocena ilościowa pozwala na detekcję mutacji typu delecje/amplifikacje występujących u pacjenta w układzie heterozygotycznym. Porównanie uzyskanego dla pacjenta wyniku z wynikiem dla prawidłowego, kontrolnego DNA, pozwala na określenie zmian w badanym materiale (13, 14, 15). Nieprawidłowe wyniki badania MLPA wymagają potwierdzenia inną techniką, np. FISH (13, 14). Przegląd literatury wskazuje na użyteczność i dużą skuteczność metody MLPA między innymi w diagnostyce pacjentów z niepełnosprawnością intelektualną (1, 3, 9, 11, 16, 17).

CEL PRACY
Celem pracy jest analiza wyników przesiewowych badań mikroaberracji chromosomowych wykonanych metodą MLPA u pacjentów z zaburzeniami rozwoju i niepełnosprawnością intelektualną. Ponadto autorzy pracy podjęli próbę oceny znaczenia tej metody, jako przesiewowej, w diagnostyce NI o nieznanej etiologii.

MATERIAŁY I METODY
Grupa badana
Badanie przeprowadzono u 256 pacjentów skierowanych do Poradni Genetycznej z powodu opóźnienia rozwoju psychoruchowego i/lub niepełnosprawności intelektualnej o nieznanej etiologii, w wieku od 3 miesiąca życia do 24 lat (średnia wieku 7 lat), w tym 115 pacjentów płci żeńskiej i 141 płci męskiej. Przed wykonaniem badania genetycznego pacjenci zostali poddani ocenie antropometrycznej oraz dysmorfologicznej. Od rodziców/opiekunów pacjentów zebrano dokładny wywiad chorobowy i rodzinny. U części pacjentów stwierdzone były wrodzone wady narządów wewnętrznych. Jednak obecność wad rozwojowych i/lub obciążony wywiad rodzinny nie były warunkiem włączenia pacjentów do badania MLPA. Do badań zakwalifikowano tych pacjentów, u których na podstawie wywiadu chorobowego i objawów klinicznych lub celowanych badań genetycznych (np.: badanie cytogenetyczne, badanie FISH, badanie molekularne) nie postawiono rozpoznania żadnego określonego zespołu genetycznego, możliwego do zdiagnozowania.

Metody
DNA izolowano z limfocytów krwi obwodowej przy użyciu kitu QiaAmp Blood Mini Kit (Qiagen) według procedury producenta. Do badania MLPA wykorzystano zestawy: P070-A2 Human Telomere-5, P064B MR1 i P245-A2 Microdeletion Syndromes-1 (MRC-Holland). Badania wykonano według załączonej procedury. Do badania użyto 100 ng DNA pacjenta. Rozdział produktów po reakcji wykonano przy użyciu sekwenatora ABI 310 z oprogramowaniem 310 Genescan software version 3.1.2 (Applied Biosystems) ze standardem masy LIZ 500. Analiza wyników została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania GeneMarker soft ware version 1.85 (Soft Genetics LLC). Wyniki o wartościach ±0,3 (zakres 0,7-1,3) w stosunku do próby kontrolnej były uważane za prawidłowe. Pozytywne wyniki badania MLPA potwierdzono badaniem FISH (Fluorescent in situ hybridization) z zastosowaniem odpowiedniej sondy fluorescencyjnej (Vysis, Kreatech). Badania te wykonano według procedury producenta. Obrazy analizowano przy użyciu mikroskopu Zeiss Imager.M1 i oprogramowania ISIS (Metasystems DE).

WYNIKI
Wykonano 313 badań MLPA u 256 pacjentów, w tym w 81 badaniach zastosowano zestaw P245-A2, w 177 zestaw subtelomerowy P070-A2, w 55 badaniach zestaw P064-B MR1.
U 15 pacjentów (4,8%) zidentyfikowano następujące mikroaberracje (tab. I): u 4 pacjentów – delecje: 1p36; 22q11.21; 22q13.33; SNRPN1 (zestaw P245-A2); u 8 pacjentów – delecje: 1ptel (2 przypadki), 4ptel, 6qtel, 16ptel, 18qtel; duplikację z delecją (postacie rodzinne): delecja 3ptel/duplikacja 15qtel oraz delecja 18qtel/duplikacja Xqtel (zestaw P070-A2); u 3 pacjentów – delecje: 1p36, 7q11.23 oraz duplikację 7q11.23 (zestaw P064B). Podsumowując: u 12 pacjentów zdiagnozowano mikrodelecję fragmentu chromosomu. W jednym przypadku zidentyfikowano duplikację a w pozostałych dwóch – złożoną mikroaberrację (delecja/duplikacja). Badanie genetyczne wykonano u rodziców wszystkich pacjentów ze stwierdzonymi mikroaberracjami. W 13 przypadkach nie wykazano obecności nosicielstwa mikroaberracji u żadnego z rodziców, co pozwoliło na rozpoznanie zmiany sporadycznej u dziecka. W dwóch przypadkach u jednego z rodziców stwierdzono nosicielstwo zrównoważonej mikroaberracji chromosomowej wykazując postać dziedziczną aberracji (tab. I).

DYSKUSJA
Mikrodelecje i mikroduplikacje chromosomowe (CNV – copy number variants), czyli delecje i duplikacje powyżej 1 kpz dotyczą około 12% ludzkiego genomu. Zależnie od miejsca ich występowania, w sekwencjach kodujących, regulatorowych lub niekodujących mogą mieć różny wpływ na fenotyp pacjenta. Dla części mikroaberracji nie określono ich znaczenia klinicznego, jednak wiele z nich jest przyczyną zespołów dysmorficznych (18). Regiony chromosomowe krytyczne dla rozwoju i funkcjonowania człowieka, które najczęściej ulegają mikroaberracjom, obejmują, wiele tzw. genów przyległych, z których każdy w sposób niezależny może potencjalnie wpływać na fenotyp pacjenta. Obserwowane zmiany kliniczne mogą być wynikiem utraty (mikrodelecja) lub nadmiaru (mikroduplikacja) genów wrażliwych na dawkę zlokalizowanych w tzw. „regionie krytycznym” (19, 20). Skutki kliniczne mikrodelecji są zwykle cięższe, niż mikroduplikacji. Mikroaberracje mogą powstać de novo lub jako wynik rearanżacji chromosomowych (translokacje, inwersje) występujące rodzinnie lub sporadycznie (19, 21, 22, 23). Jednym z ważniejszych rodzajów niezrównoważonych strukturalnych aberracji chromosomowych, będących znaczącą przyczyną zaburzeń rozwoju i niepełnosprawności intelektualnej są nieprawidłowości dotyczące subtelomerowych regionów chromosomów. Mikroaberracje subtelomerowe występujące z częstością 2,1 na 10 000 żywo urodzonych noworodków i są identyfikowane u około 5-30% pacjentów z NI (11). W naszym materiale najczęściej obserwowanymi mikroaberracjami były delecje regionów subtelomerowych, które wykazano u 10 pacjentów na 15 nieprawidłowych wyników (66,6%). Wyniki te są zgodne z obserwacjami innych autorów.
De Vries i wsp. zaproponowali system kryteriów klinicznych w diagnostyce aberracji subtelomerowych u pacjentów z zaburzeniami rozwoju i niepełnosprawnością intelektualną (24). Kryteria obejmują pięć cech, z których każda jest oceniana w skali 0-1-2: zaburzenie pre- i postnatalnego rozwoju somatycznego, cechy dysmorficzne twarzoczaszki (dwie lub więcej), towarzyszące wady rozwojowe oraz występowanie niepełnosprawności intelektualnej i cech dysmorfii w rodzinie (obciążony wywiad rodzinny). Analiza piśmiennictwa wskazuje, że proponowany schemat kliniczny kwalifikujący do badania aberracji subtelomerowych jest zbyt restrykcyjny (11, 22). Ogranicza on możliwości diagnozowania wielu mikroaberracji powstałych de novo oraz mikroaberracji o stosunkowo ubogich objawach, obejmujących jedynie izolowane przypadki zaburzeń rozwojowych i NI oraz cechy dysmorfii bez wrodzonych wad rozwojowych (24). Wyniki badań zaprezentowane w przedstawionej pracy potwierdzają te tezy (tab. II). Wszyscy pacjenci (256) kwalifikowani do badań MLPA wykazywali opóźnienie rozwoju psychoruchowego i/lub intelektualnego. Pacjentów ze stwierdzoną mikroaberracją chromosomową w badaniu MLPA (15 przypadków) poddano szczegółowej analizie klinicznej. Obciążony wywiad rodzinny występował tylko w jednym przypadku. Wewnątrzmaciczne opóźnienie wzrostu (IUGR) wykazano u 6 pacjentów (40%). Po urodzeniu wrodzone wady rozwojowe wskazano u 7 pacjentów (rozszczep podniebienia, wada serca – ubytek w przegrodzie międzykomorowej, zespół Dandy-Walkera, hipoplazja ciała modzelowatego, zarośnięcie zewnętrznych przewodów słuchowych, brak nerki oraz przerostowe zwężenie odźwiernika). Rozwój psychoruchowy w okresie niemowlęcym był znacznie opóźniony u 10 dzieci, u 2 dzieci był nieznacznie opóźniony, u kolejnych 3 – oceniany jako prawidłowy. Padaczka była obserwowana u 5 pacjentów. Również u 5 pacjentów występował znacznie opóźniony rozwój mowy, będący główną przyczyną skierowania dzieci do Poradni Genetycznej. W badaniu dysmorfologicznym wszyscy pacjenci prezentowali cechy dysmorficzne, które jednak były w większości przypadków wyrażone łagodnie lub umiarkowanie. Uzyskane wyniki badań potwierdzają tezę, że najczęstszą stwierdzaną mikroaberracją chromosomową u pacjentów z zaburzeniem rozwoju i NI są delecje subtelomerowe.

WNIOSKI
Według wielu autorów, co potwierdzają wyniki naszej analizy, badanie MLPA w kierunku wybranych zespołów mikroaberracji jest dobrą, skuteczną i tanią metodą przesiewową umożliwiającą określenie wielu genetycznych przyczyn opóźnienia rozwoju psychoruchowego i NI o nieznanej etiologii. U każdego dziecka z zaburzeniem rozwoju i/lub niepełnosprawnością intelektualną o nieznanym pochodzeniu oraz z prawidłowym wynikiem badania cytogenetycznego, powinno być wykonywane przesiewowe badanie molekularne w kierunku zespołów mikroaberracji chromosomowych, nawet, jeżeli brak jest wad rozwojowych oraz obciążonego wywiadu rodzinnego.

PIŚMIENNICTWO
1. Koolen D.A., Nillesen W.M., Versteeg M.H., Merkx G.F., Knoers N.V., Kets M., Vermeer S., van Ravenswaaij C.M., de Kovel C.G., Brunner H.G., Smeets D., de Vries B.B., Sistermans E.A.: Screening for subtelomeric rearrangements in 210 patients with unexplained mental retardation using multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA). J. Med. Genet., 2004, 4, 892-899.
2. Sogaard M., Tümer Z., Hjalgrim H., Hahnemann J., Friis B., Ledaal P., Pedersen V.F., Baekgaard P., Tommerup N., Cingöz S., Duno M., Brondum-Nielsen K.: Subtelomeric study of 132 patients with mental retardation reveals 9 chromosomal anomalies and contributes to the delineation of submicroscopic deletions of 1pter, 2qter, 4pter, 5qter and 9qter. BMC Med. Genet., 2005, 17, 6-21.
3. Kirchhoff M., Bisgaard A.M., Bryndorf T., Gerdes T.: MLPA analysis for a panel of syndromes with mental retardation reveals imbalances in 5.8% of patients with mental retardation and dysmorphic features, including duplications of the Sotos syndrome and Williams-Beuren syndrome regions. Eur. J. Med. Genet., 2007, 50, 33-42.
4. Raymond F.L., Tarpey P.: The genetics of mental retardation. Hum. Mol. Genet., 2006, 15, 110-116.
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
6. Kutkowska-Kaźmierczak A., Obersztyn E., Helias-Rodzewicz Z., Bocian E., Mazurczak T.: Subtelomeric aberration as a cause of severe somatic and psychomotor retardation in a child with dysmorphic features and CNS defects. Med. Wieku Rozwoj., 2004, 8, 949-962.
7. Obersztyn E., Mazurczak T., Helias-Rodzewicz Z., Bocian E., Kutkowska-Kazmierczak A.: Case of subtelomeric aberration as a cause of familial intellectual disability with congenital defects and dysmorphic features – problems of diagnosis and genetic counseling. Med. Wieku Rozwoj., 2003, 7, 389-401.
8. Kozłowska J., Łaczmańska I.: Badania cytogenetyczne i molekularne wykorzystywane w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Diagnostyka laboratoryjna 2008, 44(3), 379-382.
9. Palomares M., Delicado A., Lapunzina P., Arjona D., Aminoso C., Arcas J., Martinez Bermejo A., Fernández L., López Pajares I.: MLPA vs multiprobe FISH: comparison of two methods for the screening of subtelomeric rearrangements in 50 patients with idiopathic mental retardation. Clin. Genet., 2006, 69, 228-233.
10. Lam A.C., Lam S.T., Lai K.K., Tong T.M., Chau T.C.: High rate of detection of subtelomeric aberration by using combined MLPA and subtelomeric FISH approach in patients with moderate to severe mental retardation. Clin. Biochem., 2006, 39, 196-202.
11. Stegmann A.P., Jonker L.M., Engelen J.J.: Prospective screening of patients with unexplained mental retardation using subtelomeric MLPA strongly increases the detection rate of cryptic unbalanced chromosomal rearrangements. Eur. J. Med. Genet., 2008, 51, 93-105.
12. Coe B.P., Ylstra B., Carvalho B., Meijer G.A., Macaulay C., Lam W.L.: Resolving the resolution of array CGH. Genomics., 2007, 89, 647-653.
13. http://www.mrc-holland.com
14. Łaczmańska I., Łaczmański Ł.: Metoda MLPA oraz jej zastosowanie w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Postępy Biol. Komórki, 2009, 36, 555-565. 15. Jankowski S,. Currie-Frases E., Xu L., Coffa J.: Multiplex ligation-dependent probe amplification analysis on capillary electrophoresis instruments for a rapid gene copy number study. J. Biomol. Tech., 2008, 19, 238-243.
16. Monfort S., Orellana C., Oltra S., Roselló M., Guitart M., Martínez F.: Evaluation of MLPA for the detection of cryptic subtelomeric rearrangements. J. Lab. Clin. Med., 2006, 147, 295-300.
17. Rooms L., Reyniers E., Wuyts W., Storm K., van Luijk R., Scheers S., Wauters J., van den Ende J., Biervliet M., Eyskens F., van Goethem G., Laridon A., Ceulemans B., Courtens W., Kooy R.F.: Multiplex ligationdependent probe amplification to detect subtelomeric rearrangements in routine diagnostics. Clin. Genet., 2006, 69, 58-64.
18. Kozlowski P., Jasinska A.J., Kwiatkowski D.J.: New applications and developments in the use of multiplex ligation-dependent probe amplification. Electrophoresis, 2008, 29(23), 4627-4636.
19. Stankiewicz P., Lupski J.R.: The Genomic Basis of Disease, Mechanisms and Assays for Genomic Disorders. Genome Dyn., 2006, 1, 1-16.
20. Lupski J.R., Stankiewicz P.: Genomic disorders: molecular mechanisms for rearrangements and conveyed phenotypes. PLoS Genet., 2005, 1, 6-49.
21. Somerville M.J., Mervis C.B., Young E.J., Seo E.J., del Campo M., Bamforth S., Peregrine E., Loo W., Lilley M., Pérez-Jurado L.A., Morris C.A., Scherer S.W., Osborne L.R.: Severe expressivelanguage delay related to duplication of the Williams-Beuren locus. N. Engl. J. Med., 2005, 20, 1694-1701.
22. Van der Aa N., Rooms L., Vandeweyer G., van den Ende J., Reyniers E., Fichera M., Romano C., Delle Chiaie B., Mortier G., Menten B., Destrée A., Maystadt I., Männik K., Kurg A., Reimand T., McMullan D., Oley C., Brueton L., Bongers E.M., van Bon B.W., Pfund R., Jacquemont S., Ferrarini A., Martinet D., Schrander-Stumpel C., Stegmann A.P., Frints S.G., de Vries B.B., Ceulemans B., Kooy R.F.: Fourteen new cases contribute to the characterization of the 7q11.23 microduplication syndrome. Eur. J. Med. Genet., 2009, 52, 94-100.
23. Berg J.S., Brunetti-Pierri N., Peters S.U., Kang S.H., Fong C.T., Salamone J., Freedenberg D., Hannig V.L., Prock L.A., Miller D.T., Raffalli P., Harris D.J., Erickson R.P., Cunniff C., Clark G.D., Blazo M.A., Peiffer D.A., Gunderson K.L., Sahoo T., Patel A., Lupski J.R., Beaudet A.L., Cheung S.W.: Speech delay and autism spectrum behaviors are frequently associated with duplication of the 7q11.23 Williams-Beuren syndrome region. Genet. Med., 2007, 9, 427-441.
24. de Vries B.B., White S.M., Knight S.J., Regan R., Homfray T., Young I.D., Super M., McKeown C., Splitt M., Quarrell O.W., Trainer A.H., Niermeijer M.F., Malcolm S., Flint J., Hurst J.A., Winter R.M.: Clinical studies on subtelomeric rearrangements: a checklist. J. Med. Genet., 2001, 38, 145-150.

Adres do korespondencji:
Izabela Łaczmańska
Katedra i Zakład Genetyki AM
ul. Marcinkowskiego 1, 50-368 Wrocław
tel. (71) 784-12-61, fax (71) 784-00-63
[email protected]